важнейшие результаты фундаментальных исследований
Проведен скрининг большого числа растений, широко распространенных на территории Республики Коми, на содержание в них полисахаридов, в первую очередь, пектиновых веществ.
Показано, что в состав клеточных стенок большинства растений европейского Севера России входят пектиновые полисахариды с традиционной структурой, характеризующейся преимущественным содержанием линейного 1,4-a-D-галактуронана, часть остатков галактуроновой кислоты в котором метилэтерифицирована, и разветвленной областью, представленной рамногалактуронаном-I с боковыми цепями, образованными остатками арабинозы и галактозы. Выявлены пектины с уникальным строением: лемнан, апиогалактуронановый пектин ряски малой Lemna minor, и комаруман, пектин сабельника болотного ComarumpalustreL., содержащий разветвленный галактуронан в главной углеводной цепи. Установлено, что в растениях, принадлежащих к одной таксономической группе, независимо от климатических условий синтезируются близкие по моносахаридному составу полисахариды. Систематический недостаток влаги, испытываемый растением в период роста, вызывает снижение синтеза пектиновых полисахаридов в клеточных стенках растений, не влияя на моносахаридный состав полисахаридов.
Установлено, что пектиновые полисахариды обладают широким спектром иммуномодулирующей активности, обусловленной строением главной углеводной цепи и разветвленных областей макромолекулы. Выявлено уникальное свойство пектинов – полипотентность структуры в отношении действия на иммунную систему, которое основано на наличии в пектиновой макромолекуле фрагментов, способных снижать или увеличивать иммунную реактивность.
Обнаружена высокая противовоспалительная активность галактуронана, представляющего собой главную углеводную цепь всех пектинов. Разработан и запатентован способ получения активного галактуронана практически из любого растительного сырья. Наличие блоков разветвленного галактуронана в комарумане вызывает двухфазный характер иммуномодулирующего действия пектина – снижение лейкоцитарной активности сменяется ее увеличением.
Установлено, что пектины, имеющие развитую разветвленную область, которая представлена RG-I или апиогалактуронаном, стимулируют неспецифические (фагоцитоз) и антиген-специфичные клеточные иммунные реакции, в частности, реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Тонкое строение боковых углеводных цепей пектинов определяет способность стимулировать активность лейкоцитов.
Показано, что иммуномодулирующее действие зависит от молекулярной массы пектинов. Способностью снижать иммунную реактивность обладают пектины и галактуронаны с молекулярной массой свыше 300 кДа. Иммуностимулирующим действием обладают пектины с молекулярной массой до 100 кДа.
Обнаружено, что в условиях гастральной среды под действием соляной кислоты, присутствующей в желудочном соке, происходит деградация гликозидных связей пектинов. Степень деструкции пектиновых макромолекул определяется их структурными особенностями: меньшей деструкции подвергаются пектины, имеющие в составе макромолекул значительные участки галактуронана. Выявлено, что при последовательном кислотном и ферментативном гидролизе пектинов деструкция углеводных цепей пектинов сопровождается образованием высокомолекулярных фрагментов.
Установлено, что в условиях гастральной среды из пищевых растений экстрагируются пектин-белковые комплексы, содержащие в своем составе пектины и белки (ПБК). ПБК различных растений отличаются соотношением углеводной и белковой составляющих и характеризуются высокой полидисперсностью. Углеводная часть ПБК представлена пектиновыми полисахаридами, в состав углеводной цепи которых входят остатки галактуроновой кислоты, галактозы, арабинозы и рамнозы. Отличительной особенностью углеводной части является высокая степень метилэтерификации остатков галактуроновой кислоты. В состав ПБК преимущественно входят кислые белки, в аминокислотном составе которых преобладают остатки моноаминодикарбоновых кислот, заряженных отрицательно при рН<7: аспартата и глутамата. Пепсин не приводит к избирательному разрушению пептидных связей; при добавлении его в экстрагирующий раствор наблюдается снижение количества всех аминокислотных остатков.
Выявлена способность ПБК сорбировать гормоны (лептин, эстрогены), факторы роста (ЭФР) и цитокины (в частности, фактор некроза опухолей – ФНО) из гастродуоденальной среды invitro. Способность связывать низкомолекулярные биорегуляторы (<20 кДа) выше у ПБК, выделенных в присутствии пепсина. ПБК и пектины овощей ингибируют активность панкреатической амилазы и ксантиноксидазы, а также увеличивают активность микробиальной β-глюкуронидазы. Адсорбция β-глюкуронидазы на фракциях ПБК капусты выше у образцов с низкой степенью метилэтерификации остатков галактуроновой кислоты. Стимуляция активности фермента прямо пропорциональна содержанию белка в ПБК.
Разработан биотехнологический способ получения ПБК с помощью каллусных культур. Показано, что ПБК каллуса смолевки и ряски состоят в основном из слаборазветвленных пектиновых полисахаридов с молекулярной массой более 300 кДа и белка, а ПБК пижмы - из слаборазветвленных (Mw >300 кДа) и более разветвленных (Mw 100-300 кДа) пектиновых полисахаридов и белка. Добавление пектиназы и β‑галактозидазы в культуральную среду приводит к снижению молекулярной массы пектина и содержания 1,4-a-D-галактуронана, снижению содержания остатков арабинозы и галактозы в боковых углеводных цепях разветвленной области RG-I. Степень модификации полисахаридов под действием гликаназ определяется особенностями их структуры, в частности, строением боковых цепей и степенью метилэтерификации.
Найдено, что сокультивирование каллусных клеток с фитопатогенными грибами вызывает снижение молекулярной массы пектина и содержания 1,4-a-D-галактуронана в пектиновой макромолекуле. Модификация строения пектинов клеточной стенки обусловлена изменением активности гликаназ как мицелиальных, так и растительных клеток.
Создана и поддерживается коллекция каллусных культур смолевки обыкновенной, смолевки татарской, ряски малой и пижмы обыкновенной. Разработан способ биотехнологического получения растительных полисахаридов с заданными свойствами и строением с помощью каллусных культур, высокопродуктивных по синтезируемым полисахаридам. Изучено влияние различных факторов на продуцирование полисахаридов каллусными культурами.
Разработан и запатентован комбинированный способ получения очищенных препаратов полигалактуроназы, применяемой для исследования структуры пектиновых полисахаридов, с активностью, значительно превышающей активность фермента исходной культуры и известных коммерческих образцов.
Показано, что пектиновые полисахариды способствуют прорастанию семян и ускоряют рост проростков сельскохозяйственных культур, что ведет к повышению их урожайности и улучшению качества продукции.
прикладныЕ разработкИ
- разработан и запатентован общий метод препаративного выделения пектиновых полисахаридов из свежесобранного растительного сырья (Патенты РФ №№ 2149642 от 27.05.2000; 2176515 от 10.12.2001);
- установлены оптимальные составы питательных сред для получения и культивирования каллусных тканей смолевки и ряски; разработан способ выделения полисахаридов из каллусной биомассы (Патенты РФ №№ 2169769 от 27.06.2001; 2171840 от 10.08.2001; 2171841 от 10.08.2001; 2175843 от 20.11.2001);
- предложен способ получения редко встречающегося разветвленного моносахарида апиозы из полисахарида ряски малой LemnaminorL. (Патент РФ № № 2190666 от 10.10.2002);
- разработан способ получения из растительного сырья галактуронанов, обладающих противовоспалительным действием (Патент № 2344829 от 27.01.2009);
- выявлена способность ряда полисахаридов ускорять всхожесть, прорастание семян, рост проростков и увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур. Даны рекомендации по использованию данных полисахаридов при выращивании огурцов и томатов в тепличных хозяйствах;
перспективы развития отдела
- изучение структурных изменений пектинов в процессе биосинтеза и биотрансформации в желудочно-кишечном тракте животных;
- создание на основе наработанных пектинов и их фрагментов новых функциональных продуктов питания, снижающих риск возникновения ряда заболеваний, в частности, пищевых аллергий и воспалительных заболеваний кишечника;
- разработка адъювантов для пероральной иммунизации людей и животных;
- создание конъюгатов и комплексов растительных полисахаридов с биологически активными веществами;
- конструирование на основе полисахаридов наночастиц и систем направленной доставки лекарственных препаратов;
- поиск новых растительных полисахаридов, обладающих физиологической активностью.
- изучение надмолекулярных и гелевых структур пектиновых полисахаридов
